研究亮點

首次揭示了在焦亡中線粒體的損傷機制。線粒體損傷發(fā)生在細(xì)胞膜破裂之前，這表明它是焦亡中的早期事件。這種線粒體損傷是通過GSDMD-NT與存在于線粒體膜上的心磷脂的結(jié)合所引發(fā)的。

機制模式圖

研究背景

炎癥小體——細(xì)胞哨兵的衛(wèi)士

當(dāng)免疫細(xì)胞和上皮感知到病原體和危險信號時，會組裝炎癥小體，激活caspases（caspase-1、-4、-5和-11）相關(guān)蛋白。這包括通過經(jīng)典炎癥小體激活的Caspase-1，以及通過與侵入性革蘭氏陰性細(xì)菌LPS和內(nèi)源性氧化磷脂結(jié)合激活的人源caspases-4和-5以及鼠源caspase-11形成的非經(jīng)典炎癥小體。

Gasdermin D（GSDMD）是這些炎癥caspases的底物，執(zhí)行炎癥小體誘導(dǎo)的焦亡，通過釋放N末端（NT）形成孔的片段。這個N末端片段（GSDMD-NT）結(jié)合到細(xì)胞膜上的負(fù)電荷磷脂質(zhì)，形成破壞細(xì)胞膜的膜孔，釋放炎癥因子，包括白細(xì)胞介素-1（IL-1）。

線粒體——細(xì)胞命運與免疫調(diào)控的中心

在凋亡中，BAX和BAK激活通過滲透線粒體外膜（OMM），釋放凋亡因子至細(xì)胞質(zhì)，觸發(fā)線粒體外膜滲透（MOMP）并形成凋亡小體。

Caspase-9的激活提供了強大的正反饋機制，被稱為“不可逆點”。凋亡后期的線粒體通透性轉(zhuǎn)變（mPT）破壞線粒體內(nèi)膜，導(dǎo)致持續(xù)的線粒體去極化。

非caspase介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，如顆粒酶介導(dǎo)的殺傷、壞死性凋亡和鎂離子死亡，也可引起ROS生成和膜電位喪失，但大多數(shù)情況下并不涉及線粒體外膜透化（MOMP）

心磷脂（cardiolipin，CL）

心磷脂是線粒體內(nèi)膜的主要磷脂之一，是線粒體內(nèi)膜的特征性磷脂。心磷脂的合成是在線粒體內(nèi)膜上完成的。磷脂酸在外膜（OM）轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜（IM），經(jīng)過CDP二酰甘油（CDP-DG）、磷脂酰甘油磷酸（PGP）和磷脂酰甘油（PG），在IM的基質(zhì)面上轉(zhuǎn)化為CL。心磷脂與線粒體中多種蛋白復(fù)合物的組裝和活性有關(guān)。呼吸鏈復(fù)合物I至V和溶質(zhì)載體家族的蛋白質(zhì)均已顯示與CL緊密結(jié)合。CL不僅結(jié)合于這些蛋白的表面上，也促進(jìn)它們組裝成超復(fù)合體，并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。

Biosynthesis, remodeling and turnover of mitochondrial cardiolipin. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2017 Jan;1862(1):3-7.

焦亡過程中的線粒體——GSDMD和GSDME引導(dǎo)的早期損傷

在GSDMD和GSDME介導(dǎo)的焦亡早期，線粒體遭受損害，表現(xiàn)為ROS上升、膜電位下降、細(xì)胞色素c和mtDNA釋放到細(xì)胞質(zhì)。

Liao XX, Dai YZ, Zhao YZ, Nie K. Gasdermin A Prospective Target for Therapy of Diseases. Front Pharmacol. 2022 Apr 6;13:855828

GSDMD激活的焦亡會導(dǎo)致線粒體損傷，但其具體的分子機理和作用機制還尚不清楚。

研究摘要

Gasdermin D （GSDMD） 激活的炎癥細(xì)胞死亡（焦亡）會導(dǎo)致線粒體損傷，但其潛在機制和功能在很大程度上是未知的。在這里，作者發(fā)現(xiàn) N 端成孔 GSDMD 片段迅速破壞線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少、線粒體自噬、ROS、跨膜電位喪失、氧化磷酸化減弱以及線粒體蛋白和 DNA 從基質(zhì)和膜間空間釋放。在質(zhì)膜損傷之前，一旦GSDMD被切割，線粒體損傷就會發(fā)生。線粒體損傷獨立于 B 細(xì)胞淋巴瘤 2 家族，并且依賴于 GSDMD-NT 與心磷脂的結(jié)合。線粒體損傷、焦亡和炎性細(xì)胞因子釋放的典型和非典型炎癥小體激活通過心磷脂合酶（Crls1）或?qū)⑿牧字D(zhuǎn)移到OMM的干擾酶（Plscr3）的敲除來抑制。腫瘤中的磷脂干擾酶-3（Plscr3）缺乏抑制了焦亡觸發(fā)的抗腫瘤免疫。因此，線粒體損傷在細(xì)胞焦亡中起著關(guān)鍵作用。

研究結(jié)果

研究者發(fā)現(xiàn)，在焦亡過程中，THP-1細(xì)胞的線粒體形態(tài)和功能發(fā)生顯著變化：線粒體變小變圓，平均長度減半，數(shù)量減少，且出現(xiàn)自噬體內(nèi)含有受損線粒體。1小時后，大部分線粒體嵴丟失或膜結(jié)構(gòu)斷裂，顯示線粒體在焦亡早期就遭受嚴(yán)重破壞。

作者觀察到，經(jīng)nigericin處理后，GSDMD-NT能在細(xì)胞質(zhì)膜破壞前使線粒體的內(nèi)外膜通透，導(dǎo)致線粒體內(nèi)容物（如細(xì)胞色素c、ACO2和mtDNA）釋放到胞漿并進(jìn)入培養(yǎng)基。這一過程伴隨著caspase-1的增加和GSDMD的切割，從而增加了GSDMD-NT。

接下來，研究進(jìn)一步評估了經(jīng)LPS+nigericin處理的THP-1的線粒體膜電位（TMRM強度）、細(xì)胞ROS生成（DCFDA強度）和質(zhì)膜通透性（SYTOX Green吸收）。結(jié)果證明線粒體功能障礙先于細(xì)胞死亡。

作者使用溴化乙錠處理小鼠骨髓巨噬細(xì)胞以構(gòu)建線粒體缺失的細(xì)胞模型，并通過CellTiter-Glo檢測發(fā)現(xiàn)線粒體對細(xì)胞焦亡至關(guān)重要，線粒體缺失能抑制焦亡。此外，使用Mito TEMPO清除線粒體ROS后，細(xì)胞死亡受到限制，進(jìn)一步證實線粒體在焦亡中扮演重要角色。

誘導(dǎo)焦亡后，線粒體發(fā)生損傷，線粒體對于焦亡至關(guān)重要，焦亡是如何影響的線粒體呢？一個潛在的可能是GSDMD-N端“打洞”線粒體。為了確定GSDMD-NT是否與線粒體結(jié)合并介導(dǎo)線粒體功能障礙，研究者構(gòu)建了GSDMD-NT-BFP藍(lán)色熒光融合蛋白。

GSDMD-NT-BFP至少在質(zhì)膜通透前50分鐘與線粒體染料定位，證實了GSDMD-NT早期靶向線粒體。在 PI 或 SYTOX 吸收之前，MitoTracker 和 TMRM 強度逐漸降低，而 MitoSOX 信號增加。所有線粒體標(biāo)記最終消失，表明線粒體溶解。

為了證實 GSDMD-NT 與線粒體的共定位，作者在 HEK293T 中表達(dá)了 FLAG 標(biāo)記的 GSDMD-FL 或 -NT。后續(xù)實驗結(jié)果證實GSDMD-NT與線粒體共定位，并在細(xì)胞膜通透前定位于線粒體。

為了確定 GSDMD-NT 本身是否會結(jié)合并破壞線粒體膜，用重組 GSDMD 和 caspase-11 處理分離的線粒體以生成活性 GSDMD-NT，并通過對釋放的線粒體蛋白進(jìn)行免疫印跡來評估線粒體的通透性。

通過MitoSOX Red和DiIC1染色法，GSDMD和caspase-11處理分離的線粒體也分別顯著增加了ROS和降低了膜電位。進(jìn)一步為了證實GSDMD-NT孔在線粒體膜損傷中的作用，研究者在加入GSDMD和caspase-11之前先將分離的線粒體與DSF預(yù)孵育（單純抑制GSDMD打孔），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DSF阻止了線粒體釋放細(xì)胞色素c和mtDNA，暗示焦亡過程GSDMD-NT孔能使線粒體通透，損傷線粒體。

那么，GSDMD-NT如何到線粒體呢？GSDMD-NT與心磷脂具有很高的親和力，而線粒體膜不含其他已知的與GSDMD-NT結(jié)合的脂質(zhì)，因此研究者假設(shè)線粒體損傷取決于線粒體心磷脂。心磷脂由心磷脂合酶（Crls1）合成，并由磷脂干擾酶-3（Plscr3）外化至外膜（OMM），為了研究OMM心磷脂是否為GSDMD-NT介導(dǎo)的線粒體損傷所必需，研究者在iBMDMs細(xì)胞中對Crls1和Plscr3進(jìn)行了基因敲除。

在經(jīng)LPS+nigericin處理的Crls1^-/-和Plscr3^-/-iBMDMs中，GSDMD-NT沒有被招募到線粒體，線粒體完整性和膜電位、線粒體數(shù)量和平均長度以及受損線粒體百分比幾乎恢復(fù)到未經(jīng)焦亡誘導(dǎo)的WT iBMDMs中的水平。

此外，線粒體ROS以及細(xì)胞色素c和mtDNA的胞漿釋放也被阻斷。這些數(shù)據(jù)表明OMM心磷脂介導(dǎo)了GSDMD依賴性線粒體損傷。

為了研究線粒體損傷在體內(nèi)的免疫作用，研究者在敲除了J774細(xì)胞中的Piscr3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在Plscr3-/- J774細(xì)胞中，LPS+nigericin刺激的焦亡顯著減少。

而為了評估線粒體損傷在焦亡性免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)中的重要性，研究者設(shè)計了體內(nèi)實驗，結(jié)果表明線粒體損傷促進(jìn)細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤免疫。

在細(xì)胞凋亡過程中，MOMP（線粒體外膜透化作用） 會釋放 PNPT1（IMS 中的一種外切核酸酶），啟動全局 mRNA 降解，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于焦亡也會觸發(fā) MOMP，因此 PNPT1 很可能也會釋放到細(xì)胞膜，并在焦亡過程中觸發(fā) mRNA 降解。

為了驗證這一觀點，作者通過免疫熒光顯微鏡和免疫印跡法分析了 PNPT1 在 LPS- 和 LPS+ nigericin 處理的 iBMDM 中的定位情況.在 LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞中，PNPT1 定位于線粒體，但加入 nigericin 后則移至細(xì)胞膜。不出所料，PNPT1 在 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDM 中釋放受阻。通過熒光原位雜交檢測 18S rRNA 和 poly(A) mRNA，在 WT 中檢測不到 mRNA 信號，而在 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs 中 rRNA 沒有明顯變化。

分別在Plscr3^-/-和Crls1^-/-iBMDMs中異位表達(dá)WT PLSCR3和CRLS1，可恢復(fù)由nigericin或沙門氏菌誘導(dǎo)的焦亡mRNA衰減。OMM心肌磷脂是PNPT1誘導(dǎo)的焦亡mRNA降解所必需的。

為了研究PNPT1介導(dǎo)的mRNA降解是否有助于焦亡，用nigericin、LPS轉(zhuǎn)染或沙門氏菌處理WT和Pnpt1-/-iBMDM。結(jié)果表明Pnpt1缺乏會明顯減輕焦亡且PNPT1介導(dǎo)的mRNA衰變促進(jìn)了焦亡。

結(jié)論與意義

這項研究的最終結(jié)論：線粒體在焦亡中扮演了至關(guān)重要的角色。線粒體的損傷不僅會引發(fā)細(xì)胞死亡，還會導(dǎo)致炎癥。通過揭示這一機制，研究為我們提供了更深入了解焦亡的機制和潛在的治療途徑，特別是在免疫反應(yīng)和抗腫瘤免疫方面。這項研究有望為炎癥性疾病和腫瘤治療的未來提供新的思路。