腫瘤壞死因子（TNF）是一種促炎細(xì)胞因子，對(duì)維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。它通過與TNF受體1（TNFR1）結(jié)合，激活炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）通路，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。不過，TNF引發(fā)的細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡也可能導(dǎo)致多種炎癥性疾病。受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RIPK1）是TNF信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它能協(xié)調(diào)細(xì)胞的生存與死亡。RIPK1的支架功能可誘導(dǎo)炎癥和細(xì)胞存活，而其激酶功能則與凋亡和壞死性凋亡相關(guān)。

近日，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心許代超團(tuán)隊(duì)與華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院顧勁揚(yáng)團(tuán)隊(duì)合作，在 Cell 子刊Molecular Cell 上發(fā)表了題為：“Palmitoylationlicenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway”的研究論文。該研究揭示了泛素化依賴性的棕櫚?；试SRIPK1激酶活性以誘導(dǎo)下游細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)，并表明RIPK1棕櫚酰化可能是炎癥性疾病的一個(gè)可行靶點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)為理解RIPK1激酶激活提供了新的視角，并提出了針對(duì)RIPK1棕櫚?；臐撛谥委煵呗?。

文章要點(diǎn)

1）TNF刺激下的RIPK1棕櫚酰化

質(zhì)譜分析篩選出三個(gè)?；鞍祝?/span>RIPK1、TNFR1和TAB3。經(jīng)2-BP處理后，RIPK1和TNFR1的棕櫚酰化顯著減少，表明它們是2-BP敏感的棕櫚?；孜?。在HEK293T細(xì)胞中，2-BP處理使FLAG-RIPK1的棕櫚?；浇档?，確認(rèn)了RIPK1的棕櫚酰化。TNF-α刺激下，MEFs中RIPK1的棕櫚酰化水平增加，呈現(xiàn)高分子量條帶，提示泛素化修飾存在。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示，TNF-α刺激后肝臟組織中RIPK1的棕櫚酰化水平增加。研究表明，RIPK1在TNF刺激下被棕櫚?；疫@種棕櫚?；杀?/span>2-BP抑制。

圖1 TNF刺激下的RIPK1棕櫚?；?/span>

2）棕櫚?；龠M(jìn)RIPK1激酶活性

通過優(yōu)化的ABE實(shí)驗(yàn)，使用NMM標(biāo)記并經(jīng)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)RIPK1的Cys257（C257）是主要棕櫚酰化位點(diǎn)。在TNF刺激下，C257S突變體細(xì)胞系的RIPK1棕櫚酰化顯著降低，其他位點(diǎn)突變影響較小。CRISPR-Cas9技術(shù)生成的Ripk1C257S/C257S敲入小鼠的MEFs和肝臟組織中，TNF誘導(dǎo)的RIPK1棕櫚?；诧@著降低。NanoBiT技術(shù)驗(yàn)證表明，2-BP處理或C257S突變顯著減少RIPK1激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用。這些結(jié)果確定了Cys257是RIPK1的主要棕櫚?；稽c(diǎn)，并揭示棕櫚?；龠M(jìn)RIPK1激酶活性和激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用。

圖2棕櫚?；龠M(jìn)RIPK1激酶活性

3）棕櫚?；黾?/span>RIPK1細(xì)胞毒性

在MEFs中抑制保護(hù)性檢查點(diǎn)并結(jié)合2-BP或RIPK1-C257S突變，可顯著減少TNF誘導(dǎo)的RIPK1激酶依賴性凋亡。2-BP處理或C257S突變降低RIPK1激酶活性及caspase-3切割，減少?gòu)?fù)合物IIb形成，表明RIPK1棕櫚?；瘜?duì)復(fù)合物IIb組裝至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)顯示，2-BP處理或RIPK1-C257S突變能提高小鼠在TNF-α刺激下的存活率，證明抑制RIPK1棕櫚?；杀Ｗo(hù)小鼠免受TNF誘導(dǎo)的致死效應(yīng)，且RIPK1棕櫚?；诖龠M(jìn)細(xì)胞毒性中起重要作用。

圖3 RIPK1棕櫚?；黾蛹?xì)胞毒性

4）DHHC5介導(dǎo)RIPK1棕櫚?；?/span>

通過短發(fā)夾RNA敲低23個(gè)DHHC家族成員，篩選出6個(gè)PAT，其中DHHC5被驗(yàn)證為關(guān)鍵的RIPK1棕櫚?；?。在DHHC5敲低或缺失的MEFs中，TNF誘導(dǎo)的RIPK1棕櫚?；@著減少，表明其特異性參與且是必要條件。體外實(shí)驗(yàn)顯示，野生型DHHC5能有效催化RIPK1棕櫚?；?，而催化失活突變體DHHC5-C134S及RIPK1-C257S突變體則不能。鄰近連接實(shí)驗(yàn)表明，TNF處理后MEFs中RIPK1與DHHC5有顯著相互作用，且在SM-164處理后消失，提示cIAP1/2介導(dǎo)的泛素化促進(jìn)DHHC5與RIPK1結(jié)合。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，DHHC5在TNF刺激下被募集到復(fù)合物I中，且主要依賴K63連接的泛素鏈。DHHC5是催化RIPK1棕櫚?；?/span>PAT。

圖4 DHHC5介導(dǎo)RIPK1棕櫚?；?/span>

5）DHHC5促進(jìn)RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性

在DHHC5缺失的MEFs中，TNF刺激后復(fù)合物I中的p-S166 RIPK1水平顯著降低，表明DHHC5對(duì)RIPK1激酶激活至關(guān)重要。DHHC5缺失的細(xì)胞對(duì)T/5z7誘導(dǎo)的RDA和T/C/Z誘導(dǎo)的壞死性凋亡敏感性降低，且RIPK1和caspase的激活及復(fù)合物IIb的形成減少，提示DHHC5通過促進(jìn)RIPK1激酶活性調(diào)控復(fù)合物IIb組裝。同時(shí)，DHHC5缺失導(dǎo)致p-S166 RIPK1、p-T231/S232 RIPK3、p-S345 MLKL和壞死小體形成減少，表明其是RIPK1依賴性壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，DHHC5缺失顯著降低RIPK1激酶結(jié)構(gòu)域之間的同源相互作用，支持DHHC5通過促進(jìn)RIPK1棕櫚?；鰪?qiáng)其激酶活性的觀點(diǎn)?？傊?，DHHC5在促進(jìn)RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性中起關(guān)鍵作用。

圖5 DHHC5促進(jìn)RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性

6）脂肪酸放大DHHC5促進(jìn)RIPK1驅(qū)動(dòng)的肝臟損傷

與正常飲食小鼠相比，膽堿缺乏高脂飲食（CD-HFD）小鼠RIPK1棕櫚?；斤@著增加，DHHC5蛋白水平顯著升高，表明在MASH條件下RIPK1棕櫚?；鰪?qiáng)且DHHC5特異性上調(diào)。棕櫚酸（PA）處理原代肝細(xì)胞可提高DHHC5 mRNA和蛋白水平，且PA處理肝細(xì)胞中c-Jun在DHHC5啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合增強(qiáng)，表明脂肪酸通過JNK/c-Jun通路誘導(dǎo)DHHC5轉(zhuǎn)錄激活。在CD-HFD喂養(yǎng)的小鼠中，DHHC5缺失顯著降低RIPK1棕櫚酰化水平，減少RIPK1激酶活性、細(xì)胞死亡、炎癥因子表達(dá)及肝纖維化程度，表明抑制DHHC5可緩解MASH引起的肝臟損傷。Nec-1s治療CD-HFD小鼠可降低ALT和AST水平，進(jìn)一步證明RIPK1棕櫚?；?/span>MASH相關(guān)肝臟損傷中的重要性。總之，在MASH模型中，DHHC5被脂肪酸放大，增加RIPK1棕櫚?；图?xì)胞毒性，導(dǎo)致肝臟損傷加重，而DHHC5缺乏或RIPK1-C257S突變可有效減輕MASH相關(guān)肝臟損傷。

圖6脂肪酸放大DHHC5促進(jìn)RIPK1驅(qū)動(dòng)的肝臟損傷

7）RIPK1棕櫚?；毕轀p輕MASH相關(guān)肝臟損傷

RIPK1-C257S突變可抑制CD-HFD喂養(yǎng)小鼠的RIPK1激活與細(xì)胞死亡，降低血清ALT、AST水平，減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，降低促炎細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)，減輕肝臟纖維化，Nec-1s處理則削弱該保護(hù)作用。這表明RIPK1-C257S突變通過抑制RIPK1的激活和細(xì)胞死亡，有效減輕MASH相關(guān)的肝臟損傷、炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。

圖7 RIPK1棕櫚?；毕轀p輕MASH相關(guān)肝臟損傷

文章小結(jié)

研究首次揭示了泛素化依賴性的棕櫚?；试SRIPK1激酶活性以誘導(dǎo)下游細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)，并表明RIPK1棕櫚酰化可能是炎癥性疾病的一個(gè)可行靶點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)為理解RIPK1激酶激活提供了新的視角，并提出了針對(duì)RIPK1棕櫚酰化的潛在治療策略。